摘要：目的 探讨ASF1B基因在肾透明细胞癌患者中的表达水平及对临床预后的意义。方法 通过在肿瘤基因图谱(the cancer genome atlas,TCGA)及UCSC Xena数据库下载并分析肾透明细胞癌基因表达数据共607例，其中正常肾组织及癌旁组织数据72例，肾透明细胞癌数据535例。明确ASF1B基因在肾透明细胞癌组织与正常组织间的表达差异，分析ASFIB表达与患者生存时间的相关性。使用生信线上工具(GEPIA、 cBioPortal、STRING以及TIMER)探究肾透明细胞癌患者ASF1B表达与基因突变及甲基化水平相关性，研讨其与肿瘤免疫微环境的相互作用，探讨ASF1B对肾透明细胞癌的预测能力。结果 ASF1B基因在肾透明细胞癌细胞中表达水平明显高于正常肾组织中的表达水平(P=2.22e^-16)；ASF1B基因高表达组的患者生存周期明显低于ASF1B基因低表达组(P=0.024)。ASF1B基因在经过多因素回归分析(P<0.001)后可确定为肾透明细胞癌的高风险独立预后因子。ASF1B基因突变水平无法作为患者预后的诊断指标；cg06969527甲基化位点的甲基化程度与基因表达呈负相关(P=0.0048,HR=-0.16)。ASF1B基因表达水平与CD4+T细胞表达水平呈负相关(P=5.89e^-1,Rho=-0.025)，与CD8+T细胞表达水平呈正相关(P=2.04e^-10,Rho=0.29),与CD2基因表达水平呈正相关(P=2.47e^-12,Rho=0.395),与CD3D基因表达水平呈正相关(P=9.54e^-22,Rho=0.399), 与CD3E基因表达水平呈正相关(P=1.58e^-20,Rho=0.387)。结论 ASF1B基因与肾透明细胞癌患者的不良预后有关，可以作为肾透明细胞癌的独立危险因素。

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在过去的20年中，尽管肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)仍然是最致命的泌尿系统肿瘤之一，对于RCC的诊断和治疗已经得到了很大的改善。已有研究证明，大约30%的RCC患者在确诊时已经出现转移，这使得患者有着更差的预后结局。 此外，肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma, ccRCC)患者的5年疾病特异性生存率(disease-specific survival, DSS)下降了约10存活率(overall survival,OS)也仅为10～15个月。肾透明细胞癌早期更易治疗，但由于其在早期缺乏特异性症状， 往往无法引起患者的重视，导致病情出现延误；而一旦发生转移，患者的预后将会变得极差。目前针对于ccRCC传统的检查方法主要包括CT和磁共振成像，他们对ccRCC的筛查、诊断和治疗起到了重大的作用。但是传统的检查方式存在着成本高、 等待时间长、特异性和敏感性低等一系列的问题。 因此，寻找ccRCC独立的预后生物标志物显得尤为重要，这将在指导ccRCC的精确诊断及治疗上提供巨大帮助。 

组蛋白修饰与DNA结合形成表观遗传密码主要通过启用或限制转录来调节基因表达。越来越多的证据表明基因的低甲基化与基因在人类癌症(包括 ccRCC)中的上调有关。最近的一项针对低甲基化表达的研究发现，低甲基化表达可有效预测ccRCC患者的预后。例如，m5 CRNA的甲基化程度可能 影响ccRCC进展，并可用于ccRCC的诊断及患者预后的判断。同时，研究组还发现甲基化异常与肿瘤免疫原性之间存在负相关关系。肿瘤进展、转移和对抗肿瘤药物的耐药性都与异常的DNA修复有关。 肿瘤可以通过抑制基因启动子区域的修饰，从而导致这些基因的沉默。并且癌基因的激活往往也依赖于其启动子序列的低甲基化。在晚期ccRCC中，许多基因启动子区域的低甲基化会导致相关mRNA和蛋白质表达水平上调，进而引起更差的预后。 

已有大量研究表明，细胞周期进展(cell cycle progression,CCP)可用于判断疾病的发生和转移。 其中，ASF1B是典型的CCP相关基因，已被确定为潜在的治疗靶点，如乳腺癌、甲状腺肿瘤、肺腺癌、肝细胞癌等，而CCP基因甲基化水平与ccRCC 的预后之间的相关性仍不清楚。

1 资料与方法

    1.1 临床资料

    1.2 研究方法

2 结果

    2.1 ASF1B在肿瘤中的表达

    2.2 ASF1B是ccRCC的独立预后生物标志物

    2.3 ccRCC中ASF1B基因突变分析

    2.4 ccRCC中ASF1B基因的甲基化分析

    2.5 ASF1B蛋白互作功能分析

    2.6 ccRCC中ASF1B的免疫浸润分析

3 讨论

3 讨论

RCC作为一种发病率极高的恶性肿瘤，由于缺乏特异性症状，引起了许多研究人员的关注。通过广大医务工作者的共同努力，ccRCC患者的治疗和预后已经得到了极大的改善。对于复发风险高或无法接受手术切除的患者，可以使用分子靶向药物进行治疗。毫无疑问，在这个领域取得了巨大的进步；尽管如此，ccRCC作为一种发病率极高且预后较差的恶性肿瘤，需要更多的研究来寻找更好的治疗方法。 

尽管ASF1B已被证明是某些人类癌症的潜在生物标志物，但是它在ccRCC中的功能仍然未知。首先，正如UCSC Xena数据库所示，ASF1B在ccRCC中的表达无疑是上调的。此外，本研究使用了GAPIA 平台和TCGA队列来再次外部验证，都表明ASF1B的高表达与较差的生存率有关。根据多因素逻辑回归分析，研究组判定ASF1B基因的高表达与ccRCC的发生有关。此外，研究组还计算了确诊后1年、3年 和5年的生存率，表明ASF1B可用于预测ccRCC患者的生存率。随后，研究组找出ASF1B在ccRCC中高表达背后的机制。由于ASF1B基因在ccRCC患者中没有发生基因突变。因此，笔者把目光集中在基因的甲基化上。研究组发现ASF1B中唯一与表达量及患者生存期有关的甲基化位点是cg06969527，这为药物治疗提供了一个新的潜在靶点。 

迄今为止，已经有大量文章证明肿瘤发展与免疫系统之间的关系。因此，研究组对ccRCC进行了免疫浸润研究，以揭示ASF1B基因和免疫之间的生物学关系。对ccRCC免疫浸润的进一步研究表明， ASF1B基因的存在与B细胞和T细胞免疫应答显著相关。一些研究表明B细胞可以促进癌症转移，但是对于T细胞在肿瘤微环境作用的研究较少。因此， 笔者更详细地研究了T细胞相关基因，并且已经发现了以下意义十分重要的基因：CD2，CD3D和CD3E。 随后，笔者将研究集中在T细胞上，发现T细胞免疫反应相关基因在ccRCC中高度升高。以上结果表明，ASF1B可能通过与T细胞相互作用在ccRCC的 发展中发挥作用。基于这些结果，ASF1B可能通过与T细胞合作来促进ccRCC的发展。因此，笔者的分析表明了ASF1B可以预测免疫微环境，这也说明ASF1B基因与T细胞的组合可能是一种有前途的治疗方法。 

许多基因已经被定义为ccRCC的生物标志物。例如：MUC20，一种肿瘤微环境相关(Tumor Microenvironment,TME)差异表达基因(DEGs), 它的低表达与不良预后有关；Opa相互作用蛋白5(OIP5)已被提议作为一种新的免疫检查点靶标；与miR-223相关的VHL基因也在ccRCC的肿瘤组织中上调，这预示着不良结果。这些研究彼此方向不同，但它们都增加了我们对ccRCC的了解。 本研究主要集中在ASF1B在ccRCC中的作用，可能对患者的诊断和治疗有所帮助。 

本研究也有一些局限性。首先，本研究目标是检查ASF1B基因，而在临床工作中，基因检测使用频次并不十分高。此外，这些分析主要针对TCGA-KIRC队列进行，但一些结果尚未通过外部独立研究进行验证。最后，分析主要基于生物信息学技术， 但需要进一步的体外和体内研究来验证研究结果。 

综上所述，在许多人类肿瘤中，ASF1B均发生表达失调，并且ccRCC中表达量上调。上调可能是由基因低甲基化引起的，且cg06969527甲基化位点是最可能的靶向目标。在ccRCC中，ASF1B可能参与对肿瘤免疫浸润的作用。总而言之，ASF1B可以确定为生物信息学角度中肾透明细胞癌判断预后和治疗的新型生物标志物。

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