摘要：目的 观察盐霉素对膀胱癌细胞株 T24增殖、凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法 体外培养膀胱癌T24细胞，使用生理盐水和0.5、2、5 μmol/L等不同浓度的盐霉素作用于膀胱癌T24细胞24、48、72 h，采用CKK8法、EdU染色检测细胞增殖情况，TUNEL法检测细胞凋亡，ELISA法检测超氧化物歧化酶 （superoxidedismutase，SOD） 及丙二醛 （malondialdehyde，MDA），western blotting 检测 Wnt1、β- catenin、p-LRP6等 Wnt/β-catenin信号传导通路相关蛋白及 Bax、Bcl-2、Caspase-3等凋亡蛋白的表达情况。结果 相比其他浓度，5 μmol/L 的盐霉素作用 24、48、72h 的抑制率分别为 （29.66± 4.73）%、（46.88± 6.94）%、（69.22±5.74） %，均显著抑制 T24细胞增殖 （P<0.05）。5 μmol/L的盐霉素作用于 T24细胞的凋亡率 （0.33±0.02） %，呈显著降低 （P<0.05），同时抑制Wnt1、β-catenin和p-LRP6表达 （P<0.05）。此外，盐霉素可增加Caspase-3和 Bax的表达水平 （P<0.05），降低 Bal-2的表达和抑制 SOD活性、增加 MDA含量 （P<0.05），并诱导细胞凋亡。采用 Wnt、凋亡抑制剂处理，盐霉素作用的 Wnt/β-catenin信号通路蛋白 Wnt1、β-catenin和 p-LRP6水平显著增加 （P<0.05）；凋亡相关蛋白中，Bcl-2 表达增加 （P<0.05），而 Bax、Caspase-3 表达明显降低 （P<0.05），使 Bcl-2/Bax 比值显著增加 （P<0.05）。结论 盐霉素通过 Wnt/β- catenin 信号传导通路抑制膀胱癌T24细胞增殖，并通过调控Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达及诱导氧化应激促进T24细胞凋亡。

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膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤之一，其发病率在全球恶性肿瘤中排名第 12位[1]。在中国，膀胱癌的发病率正在逐年上升。截止到 2020年，60岁以上人群膀胱癌发病率已经超过肾癌发病率，位居泌尿系恶性肿瘤第一位，恶性肿瘤第八位，占中国恶性肿瘤发病率的 2.5%[2]。浅表性膀胱癌经尿道膀胱肿瘤电切术后，需要长期随访和术后膀胱灌注治疗，但约30%~80%的患者在 5年内复发[3]。鉴于现有膀胱癌化疗药物的有效率较低，迫切需要寻找更有效的治疗膀胱癌的药物。盐霉素是一种以单羧酸聚醚离子为载体的动物抗生素[4]。最近研究表明，盐霉素对许多肿瘤和肿瘤干细胞具有抗肿瘤作用[5]，目前，盐霉素在膀胱癌中的研究报告很少。本研究旨在通过实验研究揭示盐霉素对膀胱癌 T24 细胞的作用，并确定其抑制增殖和促进凋亡的作用；通过免疫蛋白印迹技术确认Wnt/β- catenin信号转导通路、Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡调节蛋白在盐霉素过程中的重要性作用，阐明其抑制 T24 细胞的增殖并促进其凋亡的作用机制。

盐霉素作为一元羧酸聚醚类离子载体动物用的抗生素，具有广泛的生物活性，具有抗菌、抗真菌、抗寄生虫、抗疟药、抗病毒等作用，主要应用于家禽的抗球虫药及反刍动物的生长促进剂。Gupta等[4]研究发现，盐霉素杀灭乳腺癌干细胞样细胞的能力比常用的乳腺癌化疗药物紫杉醇强100倍。国内外多项研究提示盐霉素抑制多种肿瘤细胞的增殖并具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

在本研究中，盐霉素同样对膀胱癌T24细胞具有显著的增殖抑制效应，且呈时间和剂量依赖性。本研究结果显示，盐霉素能够抑制膀胱癌T24细胞Wnt1、β-catenin和p-LRP6蛋白的表达水平。因此推断盐霉素可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制膀胱癌T24细胞的增殖。Wnt/β-catenin信号传导通路在动物胚胎和细胞发育、组织器官形成以及成体干细胞增殖与自我复制中起重要作用，其异常激活是多种肿瘤的发病机制之一。以Wnt/β-catenin信号旁路为靶点的药物能有效抑制肿瘤细胞增殖。多项研究表明盐霉素能通过调节Wnt/β-catenin信号通路抑制肿瘤细胞生长[5]。Liu等[6]使用western blotting检测盐霉素作用肝癌干细胞（LCSCs）后β-catenin的表达，发现盐霉素可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制LCSCs的增殖。Zhao等[7]研究发现盐霉素抑制人急性早幼粒细胞白血病细胞增殖并促进细胞凋亡，盐霉素能降低β-catenin及其靶细胞cyclin D1和Cmyc的表达，免疫荧光分析结果显示，盐霉素显著降低了细胞核和细胞质中的β-catenin水平。Li等[8]研究显示盐霉素可下调β-catenin等Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达，减低β-catenin的核易位，抑制上皮性卵巢癌（EOC）细胞的增殖、迁移和侵袭。罗玉平等[9]以Rt-PCR和Western blot法对盐霉素作用大鼠肝星状细胞后Wnt/β-catenin通路下游蛋白进行检测，发现β-catenin、cyclinD1的表达明显下降。Johannes等[10]研究提示盐霉素处理能降低结直肠癌的LRP6蛋白水平，抑制LRP6磷酸化，干扰Wnt信号通路，降低Wnt靶基因Fibronectin和Lgr5的表达，通过Wnt/β-catenin信号通路抑制直肠癌细胞的生长。Wang等[11]研究表明，盐霉素可以通过破坏β-catenin/TCF复合物、减少Wnt目标基因包括DKK1、c-Myc、Axin2、Cyclin D1的mRNA表达抑制结直肠癌细胞的生长。上述研究提示，盐霉素可能通过Wnt/β-catenin信号传导通路抑制肿瘤细胞增殖。经典Wnt/β-catenin信号通路参与多种肿瘤恶性生物学行为的调节，其异常活化同样作用于膀胱癌，并参与膀胱癌的病理过程[12-13]。

细胞凋亡是一种在基因控制下细胞主动参与程序性死亡过程，细胞凋亡受抑制可引起细胞增殖紊乱进而导致肿瘤发生、发展和转移。本研究结果显示，盐霉素能增加膀胱癌T24细胞caspase-3酶活性，并使凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值显著降低。这些实验结果表明盐霉素通过调节Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相关基因表达促进膀胱癌T24细胞凋亡。Kaplan等[14]研究发现盐霉素对人卵巢癌细胞系（OVCAR-3）具有促凋亡和细胞毒性作用，并通过qRT-PCR检测Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相关基因的表达水平，发现盐霉素通过上调凋亡基因Bax表达、下调抗凋亡基因Bcl-2表达、激活Caspase-3促进肿瘤细胞凋亡。赵毅等[15]研究显示盐霉素降低了急性早幼粒细胞白血病NB4细胞β-catenin以及下游分子C-myc、Cyclin D1的蛋白质水平，并诱导其凋亡。杜鹃等[16]研究发现盐霉素对人肝癌SK-HEP1细胞具有促进凋亡作用，其作用机制与caspase-3基因表达增加、Bcl-2基因表达降低相关。苏雷震等[17]研究显示盐霉素能上调口腔鳞癌CAL-27细胞中caspase-3蛋白的表达及诱导其凋亡。吴博等[18]实验结果显示，盐霉素与17-AAG联合用药可明显增加乳腺癌MCF-7细胞的凋亡率，qRT-PCR结果示凋亡蛋白Bcl-2表达量显著下降，而Beclin-1、Caspase-3、Bax表达量明显增加。曹露等[19]盐霉素还能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达、增强促凋亡蛋白Bax表达，调控乳腺癌干细胞凋亡。何朵等[20]对盐霉素作用后的三阴性乳腺癌细胞MDAMB-231进行Western blot检测，结果显示与对照组相比乳腺癌细胞的凋亡蛋白Bcl-2、Caspase-3蛋白表达呈剂量依赖性降低，而Bax蛋白表达呈剂量依赖性增加。吴娅玲等[21]盐霉素对人前列腺癌PC3细胞进行Western blot检测，发现盐霉素可显著增加PC3细胞Bax蛋白表达、降低Bcl-2蛋白表达，促进前列腺癌PC3细胞的凋亡。

本研究结果显示，膀胱癌T24细胞经盐霉素处理后出现SOD活性降低及MDA含量升高，提示盐霉素诱导膀胱癌T24细胞氧化应激，并通过Bcl-2/Bax途径促进细胞凋亡，而根据采用wnt、凋亡抑制剂处理的实验数据可以抑制以上的反应过程，也提示盐霉素可以抑制膀胱癌T24细胞氧化应激，并通过Bcl-2/Bax途径抑制细胞凋亡。SOD是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，其能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡过程中起到重要作用，与很多疾病的发生、发展密不可分。在人体内SOD可通过清除超氧阴离子自由基有效的抑制癌细胞生长。自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为MDA，测定MDA的量可了解机体脂质过氧化的程度，从而间接反映细胞损伤的程度。2013年Zhou等[22]研究显示盐霉素在诱导顺铂耐药的肠癌细胞SW620细胞死亡过程中增加MDA含量，下调SOD活性,通过上调Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Bax等促凋亡基因表达及下调抗凋亡基因Bcl-2表达下调诱导细胞凋亡。2021年Yu等[23]研究发现盐霉素通过降低细胞SOD活性，增加MDA含量，诱导前列腺癌细胞的氧化损伤引发细胞凋亡，结果显示盐霉素可能通过抑制Nrf2通路降低抗氧化酶的活性。

综上所述，盐霉素可抑制膀胱癌T24细胞的增殖并促进其凋亡，其作用机制可能与Wnt/β-catenin信号通路、下调Bcl-2表达及上调Bax、Caspase-3表达有关。上述研究结果为盐霉素用于膀胱癌的治疗提供了理论基础。但如何应用盐霉素于膀胱癌临床治疗还有待进一步研究。

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