摘要：目的 探讨膀胱癌微环境中轴突导向因子4D（semaphorins 4D，Sema4D）在肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAM）上的表达特点。方法 膀胱癌细胞系T24与M0型巨噬细胞共培养，通过实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测不同表型巨噬细胞及共培养组巨噬细胞中Sema4D表达量；收集37例膀胱癌患者的临床资料、病理肿瘤组织和10例癌旁正常组织，应用免疫组化染色法和免疫荧光双标法检测CD163、Sema4D表达量，对TAM浸润性及其Sema4D表达率进行临床验证。结果 极化诱导以及共培养后，PCR结果显示M2型巨噬细胞中Sema4D的表达量明显高于M0和M1型巨噬细胞，差异均有统计学意义（P=0.0190，P=0.0180），T24+M0组巨噬细胞中Sema4D的表达量明显高于M0和M1型巨噬细胞，差异均有统计学意义（P=0.0066，P=0.0254）；ELISA结果显示M2型巨噬细胞中Sema4D的表达量明显高于M0和M1型巨噬细胞，差异均有统计学意义（P=0.0052，P=0.0058），T24+M0组巨噬细胞培养上清液中Sema4D的表达量明显高于M0和M1型巨噬细胞，差异均有统计学意义（P=0.0026，P=0.0269）。肿瘤组织中CD163+细胞计数高于癌旁正常组织（36.05±14.56 vs. 12.10±5.70），差异有统计学意义（P<0.01）；肿瘤组织中Sema4D表达高于癌旁正常组织（39.14±12.34 vs. 11.00±4.65），差异有统计学意义（P<0.01），且肿瘤组织中Sema4D+TAM百分比高于癌旁正常组织（67.44±13.74 vs. 21.04±1.80），差异有统计学意义（P<0.0001）。肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC）组织中CD163+细胞计数和Sema4D表达均高于癌旁正常组织（43.37±12.48 vs. 28.33±11.98；48.78±10.18 vs.34.74±12.59），差异有统计学意义（P=0.0009，P=0.0258），且MIBC组织中Sema4D+TAM百分比高于非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）组织（70.78±11.74 vs. 60.58±12.05），差异有统计学意义（P=0.016 0）。TAM浸润性（CD163+细胞计数）及其Sema4D表达率与肿瘤T分期均呈正相关（P=0.0025，P=0.0201），与病理分级均呈正相关（P=0.009 0，P=0.0031），但与患者性别、年龄和肿瘤最大直径均无相关性（P>0.05）。结论 膀胱癌微环境中，M2型巨噬细胞表达Sema4D，可能导致膀胱癌增殖和侵袭。M2型巨噬细胞浸润性及其Sema4D表达率与膀胱癌发生和肌层浸润密切相关。

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随着人口老龄化加剧以及环境污染日益严重，膀胱癌已经成为严重危害人类健康的恶性肿瘤[1]，90%以上膀胱癌的病理类型为移行细胞癌。肿瘤相关巨噬细胞 （tumor- associated macrophages，TAM）是肿瘤微环境中的重要组成部分，包括抗肿瘤的促炎 表 型 M1 型 巨 噬 细 胞 和 促 肿 瘤 的 M2 型 巨 噬 细胞[2]。M2表型的特征为 CD163高表达，并在肿瘤微环境中通过产生血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素 2 （angiopoietin-2，Ang-2）、轴突导向因子 4D （semaphorins 4D，Sema4D） 等，促进肿瘤新生血管生成，进而导致肿瘤的增殖和侵袭[3]。Sema4D 是肿瘤微环境中的促新生血管生成蛋白，在膀胱癌[4]、前列腺癌[5]、肾癌[6]、结直肠癌[7]、胃癌[8]等多种实体肿瘤中高度表达。研究发现，胃癌等实体肿瘤组织的肿瘤微环境中 M2 型巨噬细胞高度表达 Sema4D[8]。但膀胱癌组织中，肿瘤相关巨噬细胞与 Sema4D的关系尚未明确研究。因此，本研究评估膀胱癌组织中肿瘤相关巨噬细胞与 Sema4D之间的表达关系，从而为膀胱移行细胞癌的靶向治疗提供新的研究思路。

1 材料与方法
    1.1 实验材料
    1.2 一般资料
    1.3 实验方法
        1.3.1 细胞培养与诱导极化
        1.3.2 实时荧光定量 PCR检测
        1.3.3 ELISA 法测定 Sema4D 表达量
        1.3.4 免疫组化染色法
        1.3.5 免疫荧光双标法
    1.4 统计学方法

2 结果
    2.1 M2型巨噬细胞表达及其 Sema4D 表达率的相关性
    2.2 不同组织样本中 TAM 浸润性及其 Sema4D表达率比较
    2.3 NMIBC 与 MIBC 中 TAM 浸润性及其 Sema4D表达率比较
    2.4 TAM 浸润性及其 Sema4D 表达率与临床病理的相关性研究

3 讨论

TAM 是肿瘤微环境中主要的浸润成分，具有两种亚型：M1表型和促肿瘤的 M2表型[9]。M2表型能够促进肿瘤新生血管生成、肿瘤浸润和转移[10]。肿瘤组织中 TAM 的高度浸润性导致大多数实体瘤患者预后较差，包括乳腺癌[11]、肝细胞癌[12]、头颈部肿瘤[13]和前列腺癌[14]。膀胱癌组织中，TAM 浸润密度与肿瘤组织 T 分期和病理分级密切相关，并且是膀胱癌的独立预后影响因素[15]。本研究发现 MIBC 患者CD163+TAM 计数高于 NMIBC患者，且肿瘤组织中TAM 浸润性高于癌旁正常组织。因此 TAM 浸润性在膀胱癌发生和进展过程中具有重要作用。TAM 促进血管生成的能力由上调和释放 VEGF、Ang-2、Sema4D等促血管生成因子介导[3]。Sema4D的促血管生成活性可促进“正常”血管生成，因为 Sema4D的缺失会导致血管直径变小，从而使血管壁周围细胞难以分化[16]。由于肿瘤血管通常在结构和功能上存在异常，肿瘤新生血管生成与正常血管生成存在血管成熟度差异，这可能是由于血管生成过程与血管生成因子之间平衡失调所致[17]。研究发现肿瘤来源的Sema4D具有血管生成作用。在本研究中，实时荧光定量 PCR和 ELISA已证实，M2型巨噬细胞和 T24+M0 共培养组中高表达 Sema4D，这与 Sema4D 在胃癌、结直肠癌等其他实体瘤中表达的研究结果一致[8,18]，即肿瘤微环境 M2 型巨噬细胞高表达 Sema4D。同时，靶向敲除 Sema4D 的 M2 型巨噬细胞募集内皮细胞的能力下降，从而使其促进血管成熟的能力下降[19]。因此，膀胱癌微环境中 M2型巨噬细胞通过表达和分泌 Sema4D，可能促进肿瘤新生血管生成。

肿瘤新生血管生成涉及原始血管基底膜降解、内皮细胞活化、迁移、增殖和新生毛细血管形成等，这些过程受肿瘤或周围炎性细胞分泌的血管生成因子 （例如 Sema4D） 控制[19]。在一项头颈鳞状细胞癌体内实验中，Sema4D缺失抑制肿瘤生长和新生血管生成。Sema4D作用于局部以及远处的肿瘤微环境，有助于肿瘤微环境中新生血管生成[20]。Sema4D基因敲除的乳腺癌小鼠模型体内实验表明，由于 Sema4D具有诱导肿瘤血管成熟的特性，肿瘤微环境中Sema4D 有助于肿瘤的生长和转移[21]。本研究中，免疫组化染色结果显示肿瘤组织中 Sema4D表达量高于癌旁正常组织，并且 Sema4D与膀胱移行细胞癌肌层浸润性密切相关。因此 Sema4D促肿瘤新生血管生成特性有助于膀胱癌的发生、增殖和肌层浸润。Sema4D可与 CD72和 Plexin-B受体结合，从而在血栓形成、神经系统、免疫系统和肿瘤新生血管形成中发挥重要作用。Sema4D表达水平与肿瘤进展、转移以及对放化疗的耐药性呈正相关，促进肿瘤血管生成和血管成熟，并在肿瘤的发生发展、黏附、转移和侵袭性生长中起着重要作用[22]。LI等[8]通过 Spearman 相 关 分 析 发 现 胃 癌 组 织 中 CD68 阳 性 表 达（TAM 浸润程度） 与 Sema4D 表达呈正相关。本研究首次应用免疫荧光双标法研究膀胱癌组织中 Sema4D 在 TAM 上的表达，结果显示 M2 型巨噬细胞中 Sema4D 表达率在肿瘤组织中高于癌旁正常组织，并在 MIBC 组织中表达率高于 NMIBC 组织中。因此，膀胱癌组织中的 M2型巨噬细胞与膀胱癌肿瘤微环境中 Sema4D的产生具有协同关系，这可能是促进膀胱移行细胞癌增殖和侵袭的重要因素。

本研究具有以下不足之处：首先未在体外实验验证 Sema4D促血管生成作用。但研究发现 M2型巨噬细胞刺激胃癌和结肠癌细胞分泌可溶性 Sema4D，进一步诱导人脐静脉血管内皮细胞形成管状结构，并以类似于 VEGF 的方式起作用[23]，从而在内皮细胞中诱导 Plexin- B1 表达并促进血管生成[8,18]。其次，未研究 Sema4D 与 Plexin- B1 之间表达的相关性。Plexin-B1在非免疫细胞尤其是内皮细胞中广泛表达，并作为 Sema4D的高亲和力受体，在血管生成和血管疾病中起决定性作用[23]。在人前列腺癌组织中，与非肿瘤组织相比，Plexin-B1和 Sema4D表达紧密相关并且呈高水平表达[24]。因此，未来需要更进一步进行体外、体内和临床病理学实验，探讨肿瘤相关巨噬细胞分泌 Sema4D并激活 Plexin-B1在膀胱癌组织中的机制研究，从而为膀胱癌患者抗血管生成治疗提供新的研究基础。

综上所述，膀胱癌微环境中，M2型巨噬细胞表达和分泌促血管生成因子 Sema4D，可能导致膀胱癌增殖和侵袭。M2型巨噬细胞浸润性及其 Sema4D 表达率与膀胱癌的发生和肌层浸润密切相关，为膀胱癌的靶向治疗提供新的研究思路。

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